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药学论文文章《以人二倍体细胞为生产细胞基质的人用狂犬病疫苗药学研究思路的探讨》，供大家在写论文时进行参考。
本篇论文是一篇药学硕士论文范文，自 1885 年法国巴斯德研究院第 1 支人用狂犬病疫苗诞生以来，人用狂犬病疫苗经历了从神经组织疫苗到以细胞培养狂犬病疫苗以及从非纯化、含佐剂和防腐剂疫苗到纯化、不含佐剂和防腐剂疫苗的历程。已上市人用狂犬病疫苗生产用细胞基质包括地鼠肾细、鸡胚细胞、Vero 细胞、MRC-5 细胞，分别为原代细胞系（primary cell line，PCL）、传代细胞系（continuous cell line，CCL）和二倍体细胞系（dip-loid cell line，DCL）。根据狂犬病疫苗发展阶段的演变及二倍体细胞人用狂犬病疫苗（human diploid cellvaccine，HDCV）在国外的使用情况，证明二倍体细胞生产的狂犬病疫苗为公认的安全性风险较低的疫苗。我国二倍体细胞人用狂犬病疫苗的供应仍存在很大需求，是需要鼓励的研发方向。本文以人二倍体细胞生产狂犬病疫苗的研究背景出发，对人用狂犬病疫苗生产用二倍体细胞基质及生产用毒株，以及二倍体细胞人用狂犬病疫苗的生产、研发及质控方面的相关问题进行探讨。
1 狂犬病流行及病原学研究概述
世界卫生组织报告显示，全球每年约 5. 9 万人因狂犬病死亡，大多数病例发生在发展中国家，约 40%病例发生在 15 岁以下儿童［1］。我国每年报告的人狂犬病发病死亡率位居各类法定传染病之首，近年来狂犬病疫情逐年回升，严重危害全民健康［2］。我国是狂犬病高发地区，动物传染源广泛存在，犬类饲养量大、散、管理不善，狂犬病疫苗接种率低，导致一般人群均处于易伤易感状态。暴露前后接种狂犬病疫苗及免疫球蛋白，是实现狂犬病零死亡的最佳办法［3］。狂犬病病毒（rabies virus，RV）属弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssa virus），为单股负链 RNA 病毒［4］。根据 RV 糖蛋白及核蛋白单克隆抗体的分析和鉴定，狂犬病病毒属分为 4 个血清型，其中Ⅰ型流行最广。根据 RV N 蛋白、G 蛋白、P 蛋白的研究，将狂犬病病毒属分为 7 种基因型［5］。我国学者对近 40 年来 40 多个 RV 街毒株基因进行序列分析，发现分离株均属于基因Ⅰ型，至目前为止，尚未在我国发现其他基因型 RV［6］。RV 的核糖核酸（RNA）编码 5 种蛋白，目前认为糖蛋白（G 蛋白）构成病毒表面突起，是 RV 与细胞受体相结合的部位，能诱导机体产生中和性抗体，是有效的保护性抗原。已有文献报道了 GP 的中和表位及毒力相关位点研究结果，如 GP 上存在 3 个中和抗体结合位点：GⅠ、GⅡ和 GⅢ，GP 抗原性变化经常由 GⅡ位点上 34 ～ 42、147、184 和 198 ～ 200 位氨基酸及 GⅢ位点上 330 ～ 334 位氨基酸改变引起［7］。由于糖蛋白基因在不同毒株间易发生变异，从而导致其毒力发生变化［8］。因此，对毒株氨基酸序列分析也是监测各毒株特性的重要手段之一［9］。核蛋白是病毒的主要内部结构蛋白，也是病毒组成中最保守的结构蛋白，在不同毒株之间变异较小［10］。
2 国内外狂犬病疫苗研制及使用情况
随着生物技术的发展，采用不同细胞基质及先进工艺使得狂犬病疫苗的质量不断提升。20 世纪60 年代以后，用细胞作为病毒培养基质制备的狂犬病疫苗逐渐取代了神经组织和禽胚疫苗，其中细胞培养基质主要包括动物细胞（包括原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞及传代 Vero 细胞）和人二倍体细胞。我国已批准上市的狂犬病疫苗见表 1。由于存在潜在外源因子污染等问题，不利于无菌控制，《中国药典》三部（2015 版）已不再收录原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗。目前我国批签发量最大的是以 Vero 细胞基质生产狂犬病疫苗，其优点是适于大规模生产及质量控制，缺点是残留宿主细胞 DNA具有潜在风险；而二倍体细胞是安全性风险较低的疫苗，是需要鼓励的研发方向。由于二倍体细胞培养技术难度较大、生产成本较高，主要在欧美等国家使用，如在美国，HDCV 是 FDA 批准用于人狂犬病预防的两种疫苗之一（另一种为鸡胚细胞基质）。即使在法国 Vero 细胞狂犬病疫苗获批上市，也主要销往亚洲等发展中国家，法国本土仍使用 HDCV。虽然我国生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗已于 2012 年获批上市，但由于规模化生产等瓶颈问题以及剂型、疫苗稳定性等原因，其产量及批签发量均较少，我国二倍体细胞人用狂犬病疫苗的供应仍存在较大需可实现人二倍体细胞和病毒的大规模培养，解决疫苗产量及成本问题，同时疫苗质量也不断提高。疫苗 毒种 细胞基质Vero 细胞狂犬病疫苗 PV、CTN、aG 株 Vero 细胞人二倍体细胞狂犬病疫苗 PM 株 MRC-5、WI-38 等人二倍体细胞地鼠肾细胞狂犬病疫苗 aG 株 原代地鼠肾细胞鸡胚细胞狂犬病疫苗 Flury-LEP 株 原代鸡胚成纤维细胞
1962 年，美国 Wistar 研究所 Wiktor 等将 PM-1503毒株适应于人二倍体细胞 WI-38，后将毒株转让给法国 Merieux、德国 Behring 和美国 Wyeth 3 家公司用于生产二倍体细胞人用狂犬病疫苗。法国 Merieux研究所又将该毒株在 MRC-5 细胞中进行适应性培养，并用于生产狂犬病疫苗，该疫苗于 974 年获批上市。之后赛诺菲巴斯德生产的二倍体细胞人用狂犬病疫苗于 1977 年在法国上市。美国自 1980 年也开始使用二倍体细胞人用狂犬病疫苗，每年有 2 万 ~3 万人接受暴露后免疫。我国成都康华生物制品有限公司生产的二倍体细胞人用狂犬病疫苗于 2012年获批上市。自二倍体细胞人用狂犬病疫苗上市以来，已有 40 多年在 70 多个国家应用的历史，其安全性及减针免疫，对暴露后人体应用的效果已被证实。自成都康华生物制品有限公司二倍体细胞人用狂犬病疫苗获批上市以来，国内陆续又有多家企业研制二倍体细胞人用狂犬病疫苗，采用的毒株有 PM株、PV2061 株和 CTN 株，二倍体细胞基质分别包括WI-38、MRC-5、2BS 和 KMB-17 细胞，但目前均处于报产和临床试验阶段。
3 二倍体细胞人用狂犬病疫苗生产用细胞基质
人二倍体细胞来源于正常人胚胎，为人源有限传代系，在传代过程中保持二倍体核型，避免了传代细胞生产所带来的致癌性风险，具有较高安全性，也较原代动物细胞外源因子传播风险更低。二倍体细胞包括 MRC-5、2BS、KMB17 细胞等。MRC-5 细胞多年应用于减毒活疫苗和灭活疫苗的生产，是安全性较好的生产用细胞。巴斯德、GSK、默沙东等公司均采用 MRC-5 细胞生产人用狂犬病疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、水痘减毒活疫苗、麻风腮减毒活疫苗、脊髓灰质炎疫苗等。2BS 细胞为人胚肺成纤维细胞，由北京生物制品研究所于 1973 年从流产的正常 3 月龄女性胚胎肺组织分离传代建立，后用于生产甲型肝炎减毒活疫苗和水痘减毒活疫苗。KMB17 细胞是由中国医学科学院医学生物学研究所研发并建立的细胞株，并应用此细胞研发狂犬病疫苗。应用不同细胞基质制备的狂犬病疫苗的对比见表 2。
4 二倍体细胞人用狂犬病疫苗生产用毒株
PV 株 狂犬病病毒巴斯德固定株（PV2061 株）简称 PV 株，于 1882 年由路易斯巴斯德分离获得，1983年在法国巴斯德研究院经兔脑连续传代获得 2061代毒株，经 Vero 细胞进行连续适应性传代后，病毒库为“L. 巴斯德 2061 代 ／ Vero 细胞 15 代”，后在 MRC-5细胞上进行增殖适应性传代制备疫苗用种子库。1964 年美国 Wistar 研究所的 Wiktor 教授等将 NIH保存的巴斯德衍生株 PV-11 在人二倍体细胞 WI-38适应性传代培养获得二倍体细胞适应株，并将 52 代毒株制成生产用主毒种 PM-1503 3M 株，病毒滴度可达 6. 0 LgLD50／ mL。1966 年 Wistar 研究所将此毒株转让给法国 Merieux 研究所，后改用 MRC-5 细胞培养此病毒生产冻干狂犬病疫苗。目前国内也有多家企业采用 Vero 细胞培养 PM 毒株生产狂犬病疫苗。另外还有企业采用 KMB-17 及 MRC-5 细胞培养 CTN-1 毒株进行适应性传代培养研制狂犬病疫苗，但仍未上市。也有多家企业采用 Vero 细胞培养CTN-1 株生产的狂犬病疫苗已上市多年。
5 二倍体细胞人用狂犬病疫苗的技术要求
生产用毒种 生产用毒种除了进行常规检定，包括鉴别试验、病毒滴定、无菌检查、支原体检查、病毒外源因子检查，以及免疫原性、致肿瘤试验等抗原性、免疫原性、保护力研究外，还需将毒株在二倍体细胞上连续传代进行毒株基因稳定性研究，对全基因组序列重点分析基因突变对毒株免疫原性、保护力、安全性的影响，尤其要关注发生在中和抗原表位的突变。此外，传代稳定性还应进行病毒易感性研究，在传代过程中观察各代次细胞形态、生长状况、细胞病变程度等，检测半数致死量（LD50）和糖蛋白（GP）含量，并由此确定二倍体细胞的生产使用限定代次。PM 等毒株在二倍体细胞中的适应性传代培养，其病毒易感性及增殖状态弱于 Vero 细胞，收获液病毒滴度（病毒滴度多在 6. 0 ~ 7. 0 LogLD50／ mL）低于Vero细胞培养的病毒，低于《中国药典》三部（2015 版）要求的 Vero 细胞毒种滴度标准（≥ 7. 5 LgLD50／ m L）［11］。但已有的临床研究结果显示病毒滴度并不影响后续生产疫苗的保护效力及免疫原性。对于二倍体细胞制备的毒种批病毒滴度标准可适当调整。品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定［12］，WHO用作生物制品生产基质的动物细胞培养物评价和细胞库鉴定的建议［13］，我国 2005 年颁布的疫苗生产用细胞基质的技术审评一般原则等指南开展二倍体细胞特性、建库、放行检定以及传代稳定性等研究［14］。二倍体细胞特性的研究可包括生长特性、人源细胞鉴别、外源因子检测、致肿瘤试验等。人源细胞鉴别 STR 图谱分析技术是细胞基质新的鉴别方法，通过扩增位于人基因组不同染色体上的、具有高度多态性的 DNA 短串联重复序列（short tandem repeat，STR）并测序，根据各等位基因 STR 序列的不同重复性可以为每一种人源细胞提供一个特异性的鉴别图谱，用于区别其他细胞。可鉴别生产所用的人源细胞基质是否正确、有无错用或误用。可直接检测细胞、也可通过检测疫苗获得相关数据［15］。生产用二倍体细胞的常规放行检定，包括细胞鉴别试验、无菌检查、支原体检查、细胞外源因子检查、逆转录病毒检测、特殊外源病毒因子检测、致瘤性检查，另外还需进行二倍体细胞传代稳定性试验，通过连续传代对细胞生命周期进行研究，根据细胞计数、细胞倍增时间、细胞生长状态等因素，结合病毒易感性研究，为确定二倍体细胞的生产使用限定代次提供依据，规定生产用细胞代次应限制在细胞寿命期限的前 2 ／ 3 内。除明确细胞的疫苗代次，也要对生产终末细胞进行全面检定。并对超高代次细胞进行致瘤性检查。
6 总结及讨论
狂犬病疫苗历经了地鼠肾细胞、鸡胚细胞、Vero细胞、二倍体细胞等几个阶段，根据狂犬病疫苗发展阶段的演变、二倍体细胞人用狂犬病疫苗在国外的使用情况，二倍体细胞制备的狂犬病疫苗系公认的安全性风险较低的疫苗。我国二倍体细胞人用狂犬病疫苗的供应仍存在很大需求，是需要鼓励的研发方向。目前全球已上市的二倍体细胞人用狂犬病疫苗有国外使用近 40 年的非纯化苗和国内近年来上市的纯化苗。非纯化苗具有在全球 70 多个国家使用近 40 年的应用基础，但生产工艺过程控制尚需加强。对于是否考虑采用纯化工艺进行二倍体细胞人用狂犬病疫苗的生产，针对先进工艺的评价除应考虑疫苗的安全、有效性外，还需考虑此类疫苗的产能、成本、药学稳定性及市场可及性等多种因素，是一种综合评判的指标。本文为结合该类疫苗的审评工作进行的总结，希望通过相关问题的探讨对二倍体细胞人用狂犬病疫苗的研究提供参考。
本篇论文参考文献
［1］ Rabies vaccines and immunoglobulins［S］. WHO position，2018（4）：8-10.
［2］ LI H Y. Discussion of rabies virus current situation，cause andcontrol［J］. Chin J Pest Control，2008，24（9）：707-708.（inChinese）李怀银．狂犬病流行现状、成因及防制对策探讨［J］. 医学动物防治，2008，24（9）：707-708.
［3］ WHO. New global framework to eliminate rabies［S］. 2015-12-xx.［4］ 俞永新. 狂犬病和狂犬病疫苗［M］. 北京：中国医药科技出版社，2001：161-180.
［5］ 王军志. 疫苗的质量控制与评价［M］. 北京：人民卫生出版社，2013：451-471.
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