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泽泻汤的ZXT颗粒新药临床前药学研究——源于经典名方角度
时间:2020-09-11 10:17 | 栏目:在职硕士 | 浏览:次
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ZXT颗粒和泽泻汤“标准煎液”的质量差异并与药效试验结果进行验证。结合 23-乙酰泽泻醇 B、白术内酯Ⅲ的药效作用，从含量测定、HPLC 指纹图谱的数据可在一定程度上说明 ZXT 颗粒比泽泻汤“标准煎液”的质量更佳，乙醇作为泽泻汤的溶媒时比水的品质更好，与利尿试验结果一致。出膏率、UV-Vis 指纹图谱及物理指纹谱不能直接从质量评价说明是否乙醇作为泽泻汤的溶媒时比水的品质更好，它们与药品有效性的内在联系有待进一步研究。
引 言
2017 年10 月 9 日，《中药经典名方复方制剂简化注册审批管理规定（征求意见稿）》、《中药经典名方复方制剂标准煎液的申报资料要求（征求意见稿）》及《中药经典名方复方制剂的申报资料要求（征求意见稿）》经原国家食品药品监督管理总局发布，进一步推进了《中医药法》中古代经典名方相关规定的落实[1]。经典名方作为国之瑰宝，是中医药的精髓所在，近年来一直备受业界人士关注，已成为中成药企业优先发展的重要领域。2018 年 4 月 16 日，国家中医药管理局发布《古代经典名方目录（第一批）》，泽泻汤被收录于其中。据《中药经典名方复方制剂简化注册审批管理规定（征求意见稿）》所载，古代经典名方制剂的研制分“标准煎液”研制与制剂研制两个阶段。“标准煎液”是指以古代医籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质，应作为经典名方制剂药用物质确定的基准[2,3]。经典名方的开发大体有三条途径：经典名方中药复方制剂研发、源于经典名方的中药新药研发及上市经典名方产品的二次开发[4]。2019 年 3 月 22 日，国家药监局公开征求《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求（征求意见稿）》意见，由于本课题于 2017 年开展泽泻汤的研究，故本论文中使用“标准煎液”的称谓。泽泻汤出自《金匮要略·痰饮咳嗽病》，原文记载：“心下有支饮，其人苦冒眩，泽泻汤主之。泽泻五两，白术二两，右二味，以水二升，煮取一升，分温再服。”为医圣张仲景所著，由泽泻和白术两味药组成，具有消饮利水、调补脾肾之功效，临床主要用于痰饮所致眩晕[5,6]。痰饮眩晕虽不是重症，但不时带来眩晕、耳鸣等不适感，严重者听力下降，影响患者的生活质量。西医临床上多采用调节自主神经功能、改善内耳微循环、解除迷路积水为主的药物治疗及手术治疗，但药物治疗有一定副作用，手术治疗也不能从根本上治愈疾病。中医治疗方法上讲究利水消肿、健脾益肾、活血通络、镇静安神、平肝熄风，如泽泻汤、半夏白术天麻汤、黄连温胆汤和苓桂术甘汤等。泽泻汤虽组成简单，但疗效显著，相关文献表明，泽泻中三萜类化合物具有良好的利尿药理作用，白术中白术内酯类化合物是重要的利尿及健脾的活性成分，其作为历代医家治疗痰饮眩晕之效方，目前广泛应用于临床中[7-10]。动物利尿试验表明，泽泻汤以乙醇作为提取溶媒比水的利尿效果更好，故以乙醇作为提取溶媒进行后续研究，而经典名方中药复方制剂应与传统提取溶媒一致，故选择上述第二条经典名方的开发途径，开展源于经典名方泽泻汤的 ZXT（泽泻汤）颗粒部分新药临床前药学研究，为治疗痰饮眩晕的新药开发奠定基础，为经典名方泽泻汤的综合开发提供思路。技术路线如下图所示：
第一部分 ZXT 颗粒剂研究
经典名方的开发大体有三条途径：经典名方中药复方制剂研发、源于经典名方的中药新药研发及上市经典名方产品的二次开发。经典名方中药复方制剂的管理规定中引起技术人员和企业最大关注的莫过于只需提交非临床安全性研究资料，即可申请药品批准文号。看似降低了“门槛”，但基于日本汉方制剂的广泛认可度和经典名方的研发初衷，经典名方中药复方制剂的研发难度实际很大，其发展必当引领和促进整个中药制剂的进步，需综合考虑中药特色，不断总结和创新，必定是以精品和价值作为中成药高质量发展的核心导向[11]。源于经典名方的中药新药研发，需重视基础研究、中医理论及临床实践 3 个方面。其中，基础研究需考虑中药成分复杂的特点，明晰药效作用特点、主要作用机理等；中医理论应重视中医传统知识的精髓；临床实践是检验经典名方研发成果的关键。三者为对经典名方新药成药性评价具有重要作用[11]。上市经典名方中成药二次开发，重点围绕理论、机理、质量与疗效 4 个方面展开技术提升工作，实施中药大品种培育的基本策略与路径。质量评价体系不断健全，疗效作用得到临床认可，作用机理得以清晰阐释，中医药理论进步发展[11]。以利尿药效作用为指标对泽泻汤的提取溶媒种类进行研究，结果表明，泽泻汤以乙醇作为提取溶媒比水的利尿效果更好，故决定以乙醇作为提取溶媒进行后续研究，而经典名方中药复方制剂应与传统提取溶媒一致，故选择上述第二条经典名方的开发道路，开展源于经典名方泽泻汤的部分新药临床前药学基础研究。相关文献表明，泽泻中三萜类化合物具有良好的利尿药理作用，白术中白术内酯类化合物是重要的利尿及健脾的活性成分，同时 23-乙酰泽泻醇 B 在泽泻中含量较高且稳定，ZXT 颗粒提取液中白术内酯 III 含量太低，另外固含物可从整体角度反映中药质量，故以 23-乙酰泽泻醇 B 含量及固含物为指标[9,10]。ZXT 颗粒中间体制备工艺研究中，以 23-乙酰泽泻醇 B 含量及固含物为指标，在单因素试验基础上，通过 CCD-RSM（星点设计-效应面法）优选提取工艺[12,13]；以 23-乙酰泽泻醇 B 含量为指标，对浓缩工艺、干燥工艺进行考察。根据古今剂量换算及出膏率计算，每日需服用的 ZXT 颗粒中间体干膏量为 21.84 g，结合传统用药方法，确定其剂型为颗粒剂，相对传统汤剂，中药颗粒剂携带及服用更方便[14-16]。ZXT 颗粒制备工艺研究中，以 QbD 理念为指导，将关键物理属性参数作为指标，通过单因素实验，得到最佳处方[17-24]。根据“《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求”建立 ZXT 颗粒中间体质量标准。根据《中国药典》2015 年版第四部颗粒通则下的规定，建立 ZXT 颗粒质量标准。利用水肿模型小鼠代谢笼法对 ZXT 颗粒进行主要药效学研究。依据《中国药典》2015 年版第四部原料药物与制剂稳定性试验指导原则，对 ZXT 颗粒进行影响因素、加速稳定性及初步稳定性研究。从 ZXT 颗粒中间体及成品的制备工艺和质量标准研究，到 ZXT 颗粒的主要药效学研究及初步稳定性研究，为治疗痰饮眩晕的新药开发奠定基础，为经典名方的综合研究提供理论依据。
1 ZXT 颗粒中间体制备工艺研究
以药效学试验结果为指标对 ZXT 颗粒提取溶媒进行筛选。经文献研究[9]，确定综合评分值的设定为：60% Y1+40% Y2（Y1：23-乙酰泽泻醇 B 含量；Y2：固含物），在单因素试验基础上，以综合评分值为因变量，乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间为影响因素，利用星点设计 3 因素 5 水平试验，进行二次多项式拟合，通过效应面法优选提取工艺；以 23-乙酰泽泻醇 B 含量为指标对浓缩方式、浓缩温度、浓缩时间、干燥方式进行考察。最终确定 ZXT 颗粒中间体的制备工艺，为 ZXT 颗粒中间体质量标准研究及 ZXT 颗粒剂制备工艺研究奠定基础。DXL-10 型大鼠代谢笼（苏州冯氏公司）；SQP Satorious 型电子天平（北京赛多利斯公司）；FA2004 型电子分析天平(上海良平公司)； TU-1810 型紫外可见分光光度计（北京普析公司）；DSH-10A 型电子水分测定仪（邦西仪器公司）；FA-1A-50 型冷冻干燥机（北京博医康公司）；Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）。泽泻、白术药材均购自成都荷花池中药材市场，经鉴定分别为泽泻科植物泽泻Alisma orientale( Sam. ) Juzep.的干燥块茎和菊科植物白术 Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎。23-乙酰泽泻醇 B 对照品（批号 wkq16040904，纯度≥98%，四川维克奇公司）；95%乙醇（批号 2017022001，成都科龙化工厂）；生理盐水（批号 B15042001，四川科伦药业公司）；羧甲基纤维素钠（批号 20130821，成都科龙化工厂）；氢氯噻嗪片（批号 A14202008634，三才石岐制药公司）；泽泻汤水提取物[泽泻、白术按 5:2 质量比例称取，加入 6 倍量的水，浸泡 1 小时，回流提取 3 次，每次 1 小时，过滤，合并提取液，浓缩干燥后得 382.0 g 干膏（每克浸膏相当于生药 0.3499 g）]；泽泻汤醇提取物[泽泻、白术按照 5:2 比例称取，加入 6 倍量的 80%乙醇，浸泡 1 小时，回流提取 3次，每次 1 小时，过滤，合并提取液，浓缩干燥后得 133.3 g 干膏（每克浸膏相当于生药 0.1220 g）]；3 批 ZXT 浸膏（实验室自制，批号 20180616，20180617，20180618）；怡宝纯净水。清洁级 SD 雄性大鼠，体重 180~220g，6~8 周龄，由成都达硕科技有限公司提供，合格证号：SCXK（川）2015-030。依利特 Supersil C18 色谱柱( 4. 6 mm× 250 mm，5 μm)；柱温：35℃；检测波长：208nm；进样量 10 μl；流动相：乙腈 (73%A) －水溶液(27%B)；流速：1 ml/min。
2 结论与讨论
本部分确定了ZXT颗粒制剂工艺：称取过 40 目筛的ZXT颗粒中间体粉末和糊精（m ZXT：m糊精=2:3），将ZXT颗粒中间体粉末和糊精一起过 40 目筛多次，使其混合均匀；加入无水乙醇，混匀，制成颗粒，即得，可为ZXT颗粒制剂处方及质量标准的制定奠定基础。药物成型工艺越简单越好，应以最简单的工艺达到制剂要求，既能保证药物安全性、有效性和均一性，又能节约成本和资源。通过预实验发现辅料只需润湿剂和稀释剂，即可完成颗粒的制备。以无水乙醇为润湿剂，虽然制粒效果良好，但成本较高，且要注意提高制粒速度，防止因乙醇挥发而带来的问题，并且存在一定的安全隐患，后期研究中，可对制备工艺进行进一步优化[34]。中试预实验研究结果良好，表明利用“质量源于设计（QbD）”理念，以关键物理参数为指标对ZXT处方进行设计能有效控制产品稳定性。物理指纹谱能更好地从整体角度表征药物物理性质，通过ZXT颗粒中间体粉末和ZXT颗粒物理指纹谱的相似度及各个物理参数的比较，进一步表明ZXT颗粒制剂工艺良好，选取的物理性质指标可以将原料与成品的质量联系起来，后续研究中可不断丰富物理指纹谱，以更好地评价ZXT颗粒中间体及成品。2 ZXT 颗粒成型工艺研究泽泻汤原文记载：“泽泻五两，白术二两，右二味，以水二升，煮取一升，分温再服。”根据古今剂量换算及出膏率计算，每日需服用的 ZXT 颗粒中间体干膏量为 21.84g，结合传统用药方法，确定了其最佳剂型为颗粒剂，相对传统汤剂，中药颗粒剂携带及服用更方便[14-16]。大多数中药制剂极易吸湿，吸湿后粉末能诱发出较强的粘性，继而润湿成团或形成块状物，不仅影响物料的流动性和稳定性，而且还会粘附在制药设备表面，给制剂成型过程带来困难。辅料是指在药物处方中除主药以外的所有附加物的总称，不同辅料可提供不同功能，即稀释、黏合和润滑等作用 。稀释剂可以改善药物的压缩成形性，增加含量的均匀度。含水量在 10%~14%范围的淀粉具有粘附性，流动性和压缩成形性较差，但性质稳定，可与大多数药物配伍。蔗糖黏合力强，可增强药物强度，但吸湿性较强，长期贮存会使药物硬度过大，延缓溶出。糊精润湿后即产生粘性，糊精用量多时应严格控制润湿剂用量。乳糖为优良稀释剂之一。润湿剂和粘合剂是为了将药物细粉润湿、黏合制成颗粒。药物本身具有粘性，只要加入适当液体，即能使粉粒润湿，呈现粘性，这种液体称为润湿剂，而ZXT颗粒中间体粉末本身具有粘性，故只需添加润湿剂。水为润湿剂，在转动制粒法中，常以水喷雾润湿制粒，经济实用，但应注意使水分散均匀，以免产生结块现象。当用水润湿时粘性过强，润湿不匀时，常用乙醇作润湿剂，乙醇浓度大，润湿后粘性小，反之粘性大，用乙醇作润湿剂时应迅速搅拌，并立即制粒，迅速干燥，以免乙醇挥发而使软材结团，不易制粒[34]。中药提取物和浸膏粉的物理属性是除化学属性指标以外，对制剂工艺及质量有着重要影响的重要指标，结合“质量源于设计（QbD）”理念，以关键物理属性参数为指标对制剂处方进行设计，可有效保证产品质量稳定性[17-23]。临界相对湿度（CRH）能为生产、贮藏的环境提供参考，应将生产及贮藏环境的相对湿度控制在药物的CRH值以下，以防止吸湿；吸湿性（H）指材料在一定温度和湿度下吸附水分的能力，用以表征粉末的稳定性；堆密度（Da）指粉末在规定条件下自由充满标准容器后所测得的堆积密度，是粉末的一种工艺性能；休止角（α）是表示微粒间作用力方要方法之一，常用来衡量粉末流动性；粒度表征颗粒大小均匀度，用于衡量颗粒成型工艺[34]。本部分首先对ZXT颗粒中间体进行粉体学研究，包括临界相对湿度[35,36]、吸湿性、堆密度及休止角的测定。再以QbD理念为指导，将制粒效果、关键物理属性参数（吸湿性、堆密度、休止角、粒度）作为指标，通过单因素试验，得到最佳处方[37]，并进行中试预实验研究，为ZXT颗粒制备工艺研究提供理论依据 。最后利用物理指纹谱评价方法综合表征堆积性、均一性、流动性和稳定性粉体学性质，对ZXT颗粒中间体粉末和ZXT颗粒的差异进行讨论，从整体物理性质方面验证ZXT颗粒成型工艺是否良好，原料与成品之间是否存在质量联系[38-40]。
第二部分 泽泻汤“标准煎液”研究
1 泽泻汤“标准煎液”制备工艺研究
2 泽泻汤“标准煎液”质量标准研究
第三部分 泽泻汤“标准煎液”与 ZXT 颗粒质量比对研究
1 实验材料
2 方法与结果
结 论
本论文以经典名方泽泻汤处方为基础，进行了中药六类新药 ZXT（泽泻汤）颗粒剂部分临床前药学研究工作。以利尿药效为指标，对 ZXT 颗粒的提取溶媒进行了筛选，确定了乙醇为其提取溶媒，在此基础上，完成了 ZXT 颗粒剂中间体及成品的制备工艺研究和质量标准研究，并进行了初步稳定性研究及主要药效学研究。另按照《中药经典名方复方制剂标准煎液的申报资料要求》的规定，完成了泽泻汤“标准煎液”的制备工艺及质量标准研究，并与 ZXT 颗粒进行了理化性质及药效对比研究，结论如下：
1. 确定了 ZXT 颗粒中间体的制备工艺：取泽泻和白术饮片（5:2）适量，加 6.61倍量72%乙醇回流提取，提取3次，每次2.59 h，趁热过滤，取滤液进行减压浓缩（T=60 ℃，P=-0.08～-0.09 MPa）后减压干燥（T=-60 ℃，P=-0.08 MPa）至水分在 5%以内，即得。
2. 确定了 ZXT 颗粒制剂工艺：称取过 40 目筛的 ZXT 中间体粉末和糊精（m ZXT：m糊精=2:3），将 ZXT 中间体粉末和糊精一起过 40 目筛多次，使其混合均匀，加入无水乙醇，混匀，制成颗粒，即得。
2. 确定了 ZXT 颗粒制剂工艺：称取过 40 目筛的 ZXT 中间体粉末和糊精（m ZXT：m糊精=2:3），将 ZXT 中间体粉末和糊精一起过 40 目筛多次，使其混合均匀，加入无水乙醇，混匀，制成颗粒，即得。
3. 建立了ZXT颗粒中间体的质量标准：薄层鉴别项、出膏率（不得低于 16.27%）、含量测定（23-乙酰泽泻醇B含量不低于 1.6 mg/g，白术内酯Ⅲ含量不低于 5.2 mg/g）、HPLC指纹图谱（相似度 0.884~0.961）、物理指纹谱（相似度 0.876~0.938）、UV-Vis指纹图谱（相似度 0.912~0.966）。
4. 建立了 ZXT 颗粒的质量标准：处方（泽泻 1430 g 白术 570 g）；制法；性状（棕色至棕褐色的颗粒，气微香，味微甜）；薄层鉴别项；检查项：粒度、水分、干燥失重、装量差异；含量测定（23-乙酰泽泻醇 B，每袋不低于 4.7 mg；白术内酯Ⅲ，每袋不低于14.5 mg）；溶出度（90 min 时 23-乙酰泽泻醇 B、白术内酯Ⅲ溶出达到 80%以上）；功能与主治（消饮利水、调补脾肾。用于痰饮所致眩晕；用法与用量（开水冲服。一次 2袋，一日 3 次。）；规格（每袋装 9 g）；贮藏（密封，待稳定性试验考察）。
5. 根据泽泻汤消饮利水的主要功效，通过观察小鼠生理表征，采用水肿模型小鼠代谢笼法对其进行主要药效学研究。结果排尿量和肺含水量中模型组与空白组有显著性差异（P＜0.05），ZXT 颗粒中间体中剂量组小鼠排尿量最高。表明小鼠水肿模型复制成功；提取溶媒验证一致，乙醇较水更佳；ZXT 颗粒中间体中剂量利尿效果较好。
6. 基于稳定性对药品的有效性及安全性的重要意义，对 ZXT 颗粒进行影响因素试验、加速试验和初步稳定性试验，初步稳定性试验中各项检测指标均符合 ZXT 颗粒的质量标准要求，表明其稳定性较好，目前长期稳定性研究仍在进行中。
7. 确定了泽泻汤“标准煎液”的制备工艺为：取泽泻和白术饮片（5:2）适量，加13.41 倍量水回流提取，提取 3 次，每次 2.21 h，趁热过滤，取滤液进行减压浓缩（T=80 ℃，P=-0.08～-0.09 MPa）后冷冻干燥（t预冻=2 h，T=-55 ℃，P<10 Pa），至水分在 5%以内，即得。
8. 建立了泽泻汤“标准煎液”的质量标准：薄层鉴别项、出膏率（25.29%~46.97%）、含量测定（23-乙酰泽泻醇 B 不低于 111.4 μg/g，白术内酯Ⅲ不低于 178.9 μg/g）、HPLC指纹图谱（相似度 0.673~0.897）、物理指纹谱（相似度 0.647~0.899）、UV-Vis 指纹图谱（相似度 0.886~0.943）。
9. 探究在同一质量评价方法下，ZXT 颗粒和泽泻汤“标准煎液”的质量差异，并与药效试验结果进行验证。从含量测定、HPLC 指纹图谱的数据可在一定程度上说明ZXT颗粒中间体比泽泻汤“标准煎液”的质量更佳，乙醇作为泽泻汤的溶媒时比水的品质更好，与利尿试验结果一致。
综上，本研究对 ZXT 颗粒的新药临床前药学研究内容进行了研究，但由于时间较仓促，本论文存在一些不足：
1. 2019 年 3 月 22 日，国家药监局再次公开征求《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求（征求意见稿）》意见，本课题中相关研究内容有待进一步完善。
2. 药效动物试验中，小鼠体重增长与其饮食饮水量无关联性，还有待进一步研究；模型对照组小鼠脾脏指数与空白对照组无显著性差异，后续应采用更能说明健脾功效的动物模型进行研究。
3. 稳定性研究中，由于时间限制，只收集了 6 个月长期稳定性研究数据（初步稳定性），目前长期稳定性研究仍在进行中。
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