新型AQP1抑制剂的结构优化机制研究

基于 AQP1 的结构并以 DAP-20 为先导化合物，设计了 2 个结构优化方案，合成、分离、纯化了 120 多个化合物，确定为新化合物 116 个，其中 58 个为目标化合物。通过元素分析、1H、13C-NMR、DEPT、COSY 和 NOESY 谱、X-射线单晶衍射分析确认了结构，并对反应的立体选择性和所生成的 3-位螺接 R/S-构型手性对映异构的噁二唑的构型进行了分析。目标化合物的抗肿瘤活性测试结果显示，不同的化合物对不同的细胞系上有不同程度的抑制作用，为进一步优化结构、提高抗肿瘤活性和抑制 AQP1 的表达的新探索提供了基础和帮助
一、引言

  水通道蛋白 1（Aquaporin 1, AQP1）是细胞膜上的疏水跨膜蛋白，介导水分子的转运[1]。研究证实，水通道蛋白 AQP1 和人类多种恶性肿瘤如脑瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌等密切相关，在这些肿瘤发生及发展的重要步骤中，包括肿瘤细胞增殖（Proliferation）、迁移/转移（Migration/Metastasis）、侵袭（Invasion）[2-4]以及肿瘤血管生成（Angiogenesis）[5-8]过程中均起着促进和控制作用[9-16]。通过阻断水通道蛋白 AQP1 的表达能够显著减少肿瘤血管生成并导致肿瘤进一步坏死（Necrosis），进而阻止肿瘤的生长[17, 18]；敲除 AQP1 能够显著降低肿瘤细胞的迁移。而 AQP1 过表达则能够显著增加肿瘤细胞的迁移，引发严重的侵袭并导致肿瘤进一步转移和扩散[19-21]。这些研究结果表明，以 AQP1 为肿瘤标志物（Biomarker）的抑制剂的研究将为靶向抗肿瘤新药的发现及肿瘤靶向治疗提供新的方向和途径[22-29]。但是，截至目前水通道蛋白 AQP1 的抑制剂在肿瘤临床治疗中的应用尚未见报道[12, 26]。AQP1 的结构为跨膜同源四聚体（Homotetramer），每个单体由 269 个氨基酸编码的单肽链构成，包含有 6 个-螺旋跨膜结构域（Domain）及域间连接环（Loop）A、B、C、D 和 E，其中胞内环 B 和胞外环 E 所含的高度保守的天冬酰胺酸-脯氨酸-丙胺酸（Asn-Pro-Ala）序列（NPA Motif）分子内相互配对形成水通道内孔穴呈沙漏型（Hourglass）的桶状结构，沙漏型水通道内孔穴最狭窄区域的孔径为 2.8Å，其上下通道前庭的内孔穴径为 20-25Å[24, 27]。整个水通道最狭窄的部分，仅能容纳单个水分子通过[30, 31]。然而，AQP1 如何调控水通道的详细机制至今尚不完全清晰。特异性结构加上机制不清晰这些因素导致目前 AQP1 抑制剂的研究与发现仍然处于探索性阶段，并成为了具有挑战性的难题[27-29]。

二、材料与方法

1.DAP-20 类似物的合成所用材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

MS-H-Pro+ LCD 数控加热型磁力搅拌器，DL-400 循环冷却器，WFH-203B 三用紫外分析仪，Heidolph G3 型旋转蒸发仪，DHG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱，C30 孔型玻璃仪器气流烘干器，DW-25L262 海尔-20℃低温冰箱，WD-94150 型超声波清洗器，薄层色谱（TLC，硅胶用 60GF254，青岛海洋化工有限公司），柱层析硅胶（200-300 目，青岛海洋化工有限公司），Bruker AvanccDRX600（600MHz）核磁共振仪，内标物为 TMS。所用试剂均为市售分析纯或者化学纯，除特别说明外，未经过处理直接使用。

三、结果

1. DAP-20 类似物的生成

1,2:4,5-二-O-异亚丙基吡喃果糖 T1D-果糖（18g, 0.10mol）的无水丙酮混合液（350mL），在室温剧烈搅拌下滴加入浓硫酸（1.65mL），继续搅拌至 D-果糖完全消失后，滴加 1M NaOH 溶液中和至中性，静置、过滤、丙酮洗涤，滤液减压蒸馏除去丙酮，残留物加入 CH2Cl2（350mL）溶解后用水洗涤（3100mL），干燥（Na2SO4），蒸馏得白色针状晶体 T1（14g），产率：54%，m.p.为 116~117C，与文献报道数据一致。[75]1,2:4,5-二-O-异亚丙基吡喃果糖-3-酮 T21,2:4,5-二-O-异亚丙基吡喃果糖 T1（15g）和重铬酸砒啶鎓（Pyridinium dichromate, PDC, 17g）的无水 CH2Cl2混合液（100mL）于油浴回流搅拌下滴加入乙酸酐（16mL），继续回流搅拌至 TLC 检测反应完全（环己烷:乙酸乙酯=3:2），冷却后加入乙醚（200mL）使鎓盐沉淀，滤液减压蒸馏所得残留物经硅胶柱层析分离得白色固体 T2（12g），产率：90%，m.p.为 101~101C，与文献报道数据一致。[75] δH (CDCl3): 4.60 (1H, d, J1a,1b = 9.54 Hz,H-1a), 3.98 (1H, d, J1a,1b = 9.54 Hz, H-1b), 4.72 (1H, d, J4,5 = 5.58 Hz, H-4), 4.54 (1H,dd, J5,6a = 1.68 Hz, H-5), 4.38 (1H, dd, J6a,6b = 13.44 Hz, H-6a), 4.11 (1H, d, H-6b), 1.54,1.45, 1.39 (12H, 3s, 2  (CH3)2C) ppm. δC (CDCl3): 78.07 (C-1), 110.74 (C-2), 197.10(C-3), 76.01 (C-4), 70.12 (C-5), 60.21 (C-6), 113.95, 104.26 (2s, 2  CMe2), 27.29,26.64, 26.20, 26.15 (4s, 2  (CH3)2C) ppm1,2:4,5-二-O-异亚丙基吡喃果糖-3-酮芳香酰腙 MA1-MA291,2:4,5-二-O-异亚丙基吡喃果糖-3-酮 T2（1.00g, 3.80mmol），邻、间或对位取代的苯甲酰肼（1.1equiv.）和冰乙酸（AcOH, 20L）的无水甲醇混合液（60mL）于 75C 油浴中回流搅拌至 TLC 检测反应完全。减压蒸馏所得残留物经硅胶柱层析分离得MA1-MA29。

四、讨论与分析

（1）取代基的性质 包括不同的原子（如：-F, Cl, Br, I, 电负性：F = 4.0 Cl= 3.2 Br = 3.0 I = 2.7）或基团（如：-NO2, CF3, OCF3, OAc, OCH3, CH3）的电子效应（诱导、共轭、极化、场效应）。这些具有不同电子效应取代基的引入与目标分子的极化、电荷分布等密切相关，并直接影响到与靶标分子 AQP1 的相互作用（如范德华作用）。

（2）取代基的大小 包括不同大小的原子（如：-F, Cl, Br, I, 原子共价半径：F = 0.70 Cl = 0.99 Br = 1.14 I = 1.33 Å）或基团（如：-OAc, OCH3, OCF3, NO2,CF3, CH3）的空间效应（立体、位阻效应）。这些不同空间效应取代基的引入与目标分子的大小、形状、极化等密切相关，直接关系到与靶标分子 AQP1 的契合、对接及相互作用。

（3）取代基的位置 包括在 5-芳香环上邻、间、对位三种不同的位置引入不同的原子或基团，所产生的不同的取代基效应直接影响目标分子与靶标 AQP1 的契合、对接及相互作用。

（4）杂环取代基的合成 引入含有不同种类和数目杂原子、及结构不同、共轭体系大小、性质不同的杂环共轭体系取代 5-芳香苯环，包括：（1）含 1 个杂原子如氧或硫的五元取代的呋喃或噻吩环；（2）含 2 个杂原子如氮、硫的五元取代的吡唑、噻唑环；（3）含 1 个氮杂原子的六元取代的吡啶环；（4）含 2 个氮杂原子的六元取代的吡嗪和嘧啶环；（5）含 1 个氮杂原子的吲哚环。这些杂环体系的引入期望能够为探索 AQP1 调控水通道的关键位点，为阐述 AQP1 目前尚不完全清晰如何调控的详细机制提供进一步的数据

五、结论

基于 AQP1 的结构并以 DAP-20 为先导化合物，设计了 2 个结构优化方案，合成、分离、纯化了 120 多个化合物，确定为新化合物 116 个，其中 58 个为目标化合物。通过元素分析、1H、13C-NMR、DEPT、COSY 和 NOESY 谱、X-射线单晶衍射分析确认了结构，并对反应的立体选择性和所生成的 3-位螺接 R/S-构型手性对映异构的噁二唑的构型进行了分析。目标化合物的抗肿瘤活性测试结果显示，不同的化合物对不同的细胞系上有不同程度的抑制作用，为进一步优化结构、提高抗肿瘤活性和抑制 AQP1 的表达的新探索提供了基础和帮助