山东威海红豆杉的药学研究及其水提物的安全性评价

  １．１红豆杉的研究现状

  红豆杉（７ｈｊｃｗＳｘ），又名紫杉，第四纪冰川时代遗留下的珍稀濒危植物，在植物王国中，它又被称为“活化石”、。红豆杉是我国一级保护植物，隶属于红豆杉科红豆杉属、植物，雌雄异株的多年生灌木或者常绿乔木，主要分布地位于北半球的亚热带到温带地区。在世界范围内，目前己知的红豆杉属共计１１个种和１个天然杂交种（曼地亚红豆杉）其中包括中国的４个种以及１个变种，中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉、云南红Ｓ杉和南方红豆杉。我国野生红Ｓ？杉资源广泛分布在各个地区，主要集中在西南，华南和东北地区，大范围内分散生长，地理分布的局限性，导致红豆杉的野生资源稀缺。从世界范围看，暂时还没有形成大规模的野生红豆杉林Ｍ。除了野生红豆杉分布地区存在较大差异外，其不同品种的资源蕴藏量也存在很大差异。例如我国云南红豆杉和南方红豆杉分布范围较广，资源蕴藏量大。而西藏红豆杉和东北红豆杉的资源蕴藏量则很小，并且分布地区较狭窄东北红豆杉大部分生长于东北，主要位于海拔６００－１２００ｍ的针叶阔叶混交林中，分布地区集中在吉林东部，黑龙江东南部和辽宁东部。云南红豆杉主要分布于我国的中西藏东南部，四川西南部和云南西部的季风常绿阔叶林，亚高山针叶林，湿性常绿阔叶林和针叶阔叶混交林中。中国红豆杉主要集中分布于４０多个县，位于华南和西南５００－３０００ｍ的落叶阔叶林以及华中１０００－１２００ｍ以上的山地，现有资源蕴藏量多，遭到的破坏较少。南方红豆杉也被称作美丽红豆杉，是目前中国分布范围最广的红豆杉种，主要分布地区在海拔８００－１６００ｍ的山地区域，因此它分布于众多的省市地区，例如福建，江西，浙江，台湾，广西，广东，湖南，湖北，四川，贵州，云南，安徽，陕西南部，河南西部等地区，通常会与其他针阔叶林混长在一起。西藏红豆杉生长地区海拔高达２５００－３４００ｍ，多生长于云南铁杉、乔松和高山栋林木中，主要分布在云南西北部，西藏南部和东南部。

  １．２紫杉醇的提取纯化

  现代研宄表明，红豆杉属植物含有的化学成分主要包括百余种紫杉烷类二萜化合物、黄酮类、多糖类、木脂素类、生物碱类、留体类、酚类、糖苷类、挥发油类以及微量元素类等。紫杉烷二萜类化合物根据骨架的稠和方式可分为十二种，即６／８／６（Ｉ）、５／７／６（ＩＩ）、６／１０／６（ＩＩＩ）、６／１２（ＩＶ）、６／５／５／６（Ｖ）、５／６／６（ＶＩ）、６／５／５／５／６（ＶＩＩ）、６／８／６／６（ＶＩＩＩ）、５／５／４／６／６／６（ＩＸ）、６／５／５／６Ｍ（Ｘ）、２１Ｃ－６／８／９（ＸＩ）、８／６（ＸＩＩ）。在紫杉烷的稠和方式中含有五元环、六元环、七元环、八元环、十元环和十二元环等。紫杉醇作为红豆杉中最负盛名的抗癌成分也是紫杉烷类化合物家族中的重要一员，其分子式为Ｃ４７Ｈ５１Ｎ０１４。因紫杉醇对多种肿瘤具有显著的治疗效果，己被广泛用于治疗乳腺癌和卵巢癌等疾病。紫杉醇作为一种天然化合物，其分离纯化面临许多困难，具体表现紫杉醇含量低，红豆杉树皮中紫杉醇平均含量仅为０．０１５％；红豆杉中还存在相当多的紫杉醇结构类似物，目前己经在植物中发现２００多种紫杉烷类物质；除此之外，紫杉醇作为一种生物大分子物质，在分离过程中极其不稳定易于发生反应，也容易受到温度、有机溶剂、酸和碱等环境条件的影响，发生降解反应或者异构化反应生成其它紫杉烷类化合物。紫杉醇的粗提阶段经常使用溶剂萃取法，其操作是把新鲜样品烘干粉碎后，用甲醇或乙醇等有机溶剂进行粗提取，进一步进行分离提取液，对其进行旋蒸浓缩，再通过有机溶剂（氯仿、正己烷、石油醚等）和水体系进行萃取，最终收集有机溶剂层。薄层色谱法是一种传统的色谱分析技术，简称为ＴＬＣ，其方法为对样品提取液进行浓缩，使用点样器在层析板的起始线上进行点样，待溶剂挥发后，取出层析板置于紫外灯下进行待测物质的定位，样品显色位置与标准品对照，从而对待测物质初步定性。ＴＬＣ因操作方便，设备简单，分离速度快，灵敏度较高，样品用量少，已广泛应用于天然化合物的分离与鉴定。ＴＬＣ的原理为以硅胶作为固定相的层析，依据组分之间的极性差异，当组分与固定相亲和力强时，组分与原点位置较近，反之，样品移动距离远。薄层层析的技术关键是固定相的选择和展开剂极性的设定，以及确定待测组分的ＲＮｔｆ４Ｇ］。薄层层析是一种微量、快速的层析方法，可以对待测物质简单定性。高效液相色谱法，也称为ＨＰＬＣ，是在定性的基础上，进一步对待测物质进行分离纯化，ＨＰＬＣ可以通过调节不同的实验条件下较好的分离出待测物质，但由于紫杉醇在红豆杉植物中含量低，受环境影响易分解，而且还有数十种紫杉烷类化合物共同存在，ＨＰＬＣ难以精确分离得到紫杉醇纯品液相色谱－质谱联用技术，又称为ＬＣ－ＭＳ，是利用ＨＰＬＣ和大气压化学电离质谱联用技术确定微量化合物的含量［Ｎ。ＬＣ－ＭＳ应用广泛，对大部分的化合物几乎都适用，在很大程度上解决了实验分析过程中紫杉醇热不稳定的难题，对于在ＨＰＬＣ上没完全分离的紫杉烷类似物，通过ＭＳ的特征离子质量色谱图对其进行准确定量；ＭＳ具有高灵敏度，且检测限低的优点，即使在紫杉醇浓度较低的情况下也能够准确定性定量；且分析时间快，自动化程度高，也可以减少检测时间，从而更好更快的检测出紫杉醇的含量。

  ２．１实验材料

  实验样品：山东省荣成天一红豆杉种植技术开发有限公司种植的红豆杉（以下简称山东威海红豆杉）

  ２．２实验方法

  对山东威海红豆杉进行基源鉴定。观察红豆杉的外观性状。山东威海红豆杉叶片洗净后，捏紧两个并排的刀片迅速切割，将薄片置于盛有清水的培养皿中，多次取样，选择较薄的切片材料制成临时水玻片进行显微观察；茎切片制作同上。实验流程：（１）取山东威海红豆杉叶片置于７０°Ｃ烘箱内干燥６ｈ，叶片干燥完成后置于高通量研磨器进行研磨粉碎，每次ｌｍｉｎ，研磨３次。（２）将粉碎后的叶片粗粉过筛后，从中准确称量３ｇ粉末，置于２５０ｍＬ圆底烧瓶中。在烧瓶内加入６０ｍＬ甲醇，进行加热回流实验，２ｈ后收集甲醇提取液。（３）在沉淀中继续加入３０ｍＬ甲醇加热回流１ｈ，收集甲醇提取液，重复操作一次。合并３次收集到的甲醇提取液，过０．４５滤膜后，置于水浴温度为３０°Ｃ的旋转蒸发仪中浓缩至６０ｍＬ。（４）在浓缩液中加入６０ｍＬ的正己烷溶液进行萃取实验，充分反应后静置分层，弃上层液，萃取４次。合并萃取溶液，置于水浴温度为３０°Ｃ的旋转蒸发仪中浓缩至１５ｍＬ，过０．４５ｐｉｎ滤膜，得到紫杉醇粗提物。标准品制备：取紫杉醇标准品２ｍｇ，溶于ｌｍＬ甲醇溶液中，配置成浓度为２ｍｇｉｍｌ／１的紫杉醇标准液。实验过程：展开剂为三氯甲烷与甲醇１２：１（ｖ：ｖ）的混合物，在层析板标记起始线，分别吸取样品液和标准液进行点样，置入层析缸内进行展开。待展开剂跑至硅胶板的３／４处时，将硅胶板从层析缸内取出，标记溶剂前沿，待挥发剂挥发完全，置于２５４ｎｍ三用紫外灯下进行观察，比较标准品和样品位置，计算Ｒｆ值（Ｒｆ值是指薄层色谱中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值，Ｒｆ＝ａ／ｂ）。

  ３．２实验方法

  第四章  山东威海红豆杉的安全性评价