MCC950对七氟烷所致的新生大鼠大脑神经毒性分析

 MCC950 通过抑制由七氟烷长时间麻醉所致的新生大鼠海马区 NLRP3 炎性小体的激活和抑制细胞焦亡，进而减轻新生大鼠海马 CA1 区神经元的损伤，最终减轻新生大鼠成年后学习和记忆能力的损伤
一、引言

  美国食品与药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）在 2016 年12 月发布一项药物安全报告：对处于妊娠晚期即孕期后 3 个月的孕妇和 3 岁以下的婴幼儿重复或长时间使用全身麻醉药和镇静药，可能会损伤婴幼儿大脑的神经发育[1]。人类的大脑快速发育期正处于这个阶段，在此期间如果频繁、长时间接受全身麻醉药，可能会引起发育期大脑突触的异常发育，神经退行性变和成年后认知功能障碍等[2]。七氟烷作为 FDA 点名的众多麻醉药物之一，由于其诱导后具有平稳的血流动力学、作用时间维持相对较短、对呼吸道的影响小、代谢快等优点，被广泛应用于婴幼儿的麻醉[3]。然而，许多基础研究显示七氟烷可引起例如神经细胞凋亡、tau 蛋白磷酸化、神经元异常放电、神经炎症、活性氧的积累以及新生鼠成年后认知功能障碍等问题[4-7]。针对七氟烷可能会影响小儿神经发育这一问题，由于缺乏临床数据的支撑，且具体的神经毒性作用尚未明确。所以亟待明确其机制及保护措施，为临床提供理论与实践指导。炎性小体是由模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)参与组装的多聚蛋白复合体，是天然免疫的重要组成部分[8]。而核苷酸结合域和富含亮氨酸重复蛋白 3 (NOD like receptor protein 3，NLRP3)是目前公认的研究最为广泛的炎性小体，处于炎症反应的核心地位，可以通过触发细胞焦亡来驱动宿主进行免疫应答。它主要由 NLRP3 蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speak syndrome，ASC）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白-1（Cysteiny1 aspartate specific proreinase-1，Caspase-1）前体组成，并且可被麻醉药激活（例如七氟烷和异氟烷等）[9]。当细菌、病毒、麻醉药、有毒物质侵入机体时，NLRP3 炎性小体通过识别病原体相关的分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)或损伤相关的分子模式(damage associated molecular pattern，DAMPs)信号，启动炎症的级联反应，促进促炎性细胞因子白介素 1-β（Interleukin-1-β，IL-1β）和白介素 18（Interleukin-18，IL-18）的分泌与释放[10]。这些细胞因子在启动固有免疫反应或参与神经炎症中发生、进展中发挥着关键作用[11]。由于促炎细胞因子的过度分泌，可以引起例如白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症因子大量释放，从而导致炎症瀑布效应[12, 13]。近期有研究表明，老年大鼠经七氟烷暴露后可激活海马区的 NLRP3 炎性小体，并且促进促炎细胞因子 IL-1β、IL-18的分泌与释放，引起老年大鼠的认知功能障碍[14]。因此，我们推测 NLRP3 炎性小体的激活可能是七氟烷所致发育期神经毒性的机制之一。

二、材料与方法

2.实验方法

2.1 动物实验

2.1.1 实验动物选择及分组

  实验动物选取湖北医药学院实验动物中心 SPF（specific pathogen-free）环境下的 SD 新生大鼠。当天出生的大鼠日龄记为 P 0，第二天为 P 1，以此推算选取日龄为 P7、体重约为 12-15 g 的大鼠，雌鼠、雄鼠数量各半。动物饲养环境洁净，温度控制在 22-24℃，相对湿度控制在 50-60%，保持 12 h 昼夜交换，保证可自由获得饮用水和食物。需要进行水迷宫实验的新生大鼠，实验操作完成后，放回原笼和母鼠一起饲养，待养到 21 天断奶后，分笼饲养至第 33 天（P 33）行水迷宫检测。所有的实验设计和动物实验方案都按照国家实验动物伦理规章制度进行，并且通过了湖北医药学院实验动物伦理委员会的审批。将新生 P7 大鼠按照筛选标准按随机数字表法分为以下四组：①对照组（Con）、②MCC950 组（MCC950）、③Sevo组（Sevo）、④MCC950+Sevo 组（MCC950+Sevo）。Con 组腹腔注射与 MCC950组等体积的无菌 PBS 溶液；MCC950 组腹腔注射 MCC950（10 mg/kg）；Sevo 组：将 P7 大鼠置于麻醉诱导室，2.5%七氟烷持续吸入 6 h，保留自主呼吸；MCC950+Sevo 组：经腹腔注射 MCC950（10 mg/kg），30 min 后 2.5%七氟烷持续吸入 6 h，保留自主呼吸。