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木瓜蛋白酶对木瓜蛋白酶诱导的MPa形成和单核细胞活化的影响

时间:2021-10-18 17:47 | 栏目:MPA行政管理论文 | 浏览:

硕士论文网第2021-10-18期,本期硕士论文写作指导老师为大家分享一篇MPA行政管理论文文章《木瓜蛋白酶对木瓜蛋白酶诱导的MPa形成和单核细胞活化的影响》,供大家在写论文时进行参考。
  摘要 目的:观察木瓜蛋白酶对单核细胞-血小板聚集物(MPA)形成及其诱导的单核细胞活化的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法:分离单核细胞和富血小板血浆(PRP),将实验分为 3组:0、20、80U/L 木瓜蛋白酶组,分别测定不同浓度木瓜蛋白酶与单核细胞和血小板(PLT)共孵育后以及木瓜蛋白酶与血小板单独孵育后 MPA形成、P-选择素和 CD11b表达水平,木瓜蛋白酶与单核细胞孵育后的 MPA 形成和 CD11b 表 达水平,计算各浓度木瓜蛋白酶对 MPA 和 CD11b的抑制率。结果:随药物浓度增加,木瓜蛋白酶与单核和 PLT 共孵育后以及木瓜蛋白酶与血小板单独孵育后 MPA 形成、P-选择素和 CD11b表达水平显著降低,木瓜蛋白酶与单核细胞单独孵育后 MPA 形成和 CD11b表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01 或 0.001)。各处理组中,80U/L 组对 MPA 和 CD11b 的抑制率均显著高于 20U/L 组(P<0.01),木瓜蛋白酶与血小板和单核细胞共孵育组 MPA 和 CD11b 抑制率均显著高于其余两组,差异均有统计学意义(P<0.001)。结论:木瓜蛋白酶可通过抑制血小板 P-选择素表达和单核细胞与血小板结合途径而对 MPA 形成及其诱导的单核细胞活化有抑制作用,这可能作为其可应用于抗血栓和动脉粥样硬化防治的新机制。关键词 木瓜蛋白酶;单核细胞-血小板聚集物;P-选择素;单核细胞活化缺血性心脑血管疾病主要的病理生理基础是动脉粥样硬化(AS),但其发病机制迄今尚未完全明了;然而血小板和白细胞参与的炎症反应在动脉硬化性血栓形成性疾病的发生和发展中起着重要作用[1],其 中 单核细胞-血小 板聚集 物(MPA)在动脉粥样硬化的发生、发展以及诱发心脑血管疾病中起决定性的作用。因此,MPA 已日益成为预防和治疗动脉粥样硬化性疾病药物的靶点,抗 MPA 无疑是防治动脉粥样硬化性血栓性疾病的关键[2]。我们之前的研究表明,木瓜蛋白酶对血小板活化有抑制作用[3];然而迄今为止,木瓜蛋白酶是否可通过抑制 MPA 形成并对单核细胞活化有抑制作用从而在抗动脉粥样硬化中有价值则并不清楚。因此,我们通过测定木瓜蛋白酶与血小板和单核细胞的不同作用方式下 MPA 形成、血小板和单核细胞活化水平,以观察其对 MPA形成及其诱导的单核细胞活化的抑制作用,并初步探讨其机制。
  关键词:木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶,MPa形成,单核细胞活化
 

  1 材料与方法

  1.1 研究对象
  实验所需枸橼酸三钠和肝素抗凝静脉血采自8名20~26岁的健康人员,其中男4例,女4例,并取得受试者知情同意,采血前10d内未服用任何药物。
  1.2 仪 器 与 试 剂
  Beckman-Coulter FC500-MCL流式细 胞仪,改 良 Neubauer计 数 板,木 瓜蛋白酶(6 000uspU/mg,美国 Merk公司),ADP(美 国 Sigma 公 司 ),CD62-PE、CD61-FITC、CD14-PE及 CD11b-FITC单克隆抗体(法国Im-munotech公司)及 TEN 缓冲液(自配);淋巴细胞分离 液 (北 京 鼎 国 昌 盛 生 物 技 术 公 司 ),RP-MI1640培养液(上海佳和生物科技有限公司)。
  1.3 富血小板血浆制备、单核细胞分离和鉴定
  枸橼酸钠抗凝全血以 150 g 离心 10min,取上清富 血 小 板 血 浆 (PRP),然 后 以 1 500 g 离 心10min,取上清贫血小板血浆(PPP),PRP以 PPP调整血小板(PLT)浓度为 180×109/L备用。采用 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 肝 素 抗 凝 血 单 核 细 胞(Mo)[4]。终浓度10U/mL 肝素抗凝全血用 RP-MI1640培养液1∶1稀释后,按2∶1比例沿管壁滴 加 于 淋 巴 细 胞 分 离 液 之 上,1 000 g 离 心15min,取血浆与分离液界面的白膜层细胞,加到预先加入 RPMI1640培养液的分离管中,1 000 g离心 10min。离心后,可见白色的细胞沉 淀,沉淀经反复洗 两次,加入 RPMI1640 培养基,将 细胞吹打均匀,37 ℃、5% CO2 培养箱内静置培养0.5h,使 Mo贴壁,未贴壁的为淋巴细胞,小心吸去培养液,加 入新鲜的 RPMI1640 培养基,计 数板计数并调节细胞浓度为 1.0×108/L。以流式细胞仪检测 Mo CD14表达率大于 90%为合格标本。临用前以 RPMI1640 培养液调 节 细 胞 浓 度至5×10
7/L。
  1.4 木瓜蛋白酶与 Mo和 PLT
  共孵育后 MPA、CD62P和 CD11b的表达 Mo悬液中分别加入等量 PRP悬液,轻轻充分混匀,分别加入3种不同浓度(0、20、80U/L)木瓜蛋白酶溶液,充分混匀后,置于 37 ℃ 水浴箱孵育 15min。然后分别加入终浓度 5μmol/L ADP 诱导,用流式细胞仪测定样本 CD63/CD14(MPA)、CD62P 和 CD11b表达水平。
  1.5 木瓜蛋白酶与 PLT孵育后
  MPA、CD62P和CD11b的表达 前述制备的 PRP中分别加入等量 不 同 浓 度 木 瓜 蛋 白 酶 溶 液,于 37 ℃ 孵 育10min 后加入终浓度为 5μmol/L ADP,测定 P-
选择素表达水平;同时将木瓜蛋白酶作用的活化血小板悬液加入等量 Mo悬液中,充分混匀,孵育15min,以流式细胞仪测定 MPA 和 CD11b表达水平。
  1.6 木瓜蛋白酶与 Mo孵育后 MPA 和 CD11b的表达
  Mo悬液中分别加入前述不同浓度的木瓜蛋白酶溶液,37 ℃ 孵育10min;PRP中加入终浓度为 5μmol/L ADP活化血小板,取活化血小板悬液,加于等量木瓜蛋白酶孵育后的 Mo悬液,37 ℃ 水浴孵育 15min,以流式细胞仪测定 MPA和 CD11b表达水平。
  1.7 流式细胞检测
  (  1)P-选择素检测:木瓜蛋白酶处理后各组样本分别加入等量3%多聚甲醛溶液,室温避光固定 15min,再分别加入鼠抗人CD62-PE单克隆抗体和同型抗体对照,室温避光作用15min,用 TEN 缓冲液1∶3(V/V)稀释,流式细胞仪检测计数 10 000 个血小板,结果以阳性百分率%表示。(2)MPA 及 CD11b检测:木瓜蛋白酶处理后各组样本分别加入等量鼠抗人 CD14-PE和 CD41-FITC单克隆抗体及同型抗体对照,流式细胞仪检测单核细胞,测定 CD11b表达百分率和表达 CD41的单核细胞百分率(MPA 水平)。重复试验6次。
  1.8 统计学处理
  正态分布计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件,不同处理组间比较采用配对t检验,确切率的比较采用 χ2 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 木瓜蛋白酶与 Mo和PLT共孵育后对 MPA和单核细胞活化 的 影响
  随木瓜蛋 白 酶浓度增高,MPA、CD62P 和 CD11b 表 达均 显 著 降 低 (P<0.01)。见图1。
木 瓜 蛋 白 酶 与 单 核 及 PLT 共 孵 育 后 MPA 和 CD11b表达水平比较
  2.2 木瓜蛋白酶与 PLT 孵育后对 MPA 形成和单核 细 胞 活 化 的 影 响
  三 组 间 MPA、CD62P、CD11b表 达 水 平 有 统 计 学 差 异 (P<0.001)。
20U/L 组 MPA、CD62P、CD11b 表 达 水 平 显 著低于 0U/L 组,80U/L 组显著低于 20U/L 组,差异均有统计学意义(P<0.01)。
  2.3 木瓜蛋白酶与 Mo孵育后对 MPA 形 成 和Mo活化的影响
  三组间 MPA 和 CD11b表达水平均有统计学差异(P<0.01);20U/L 组 MPA和 CD11b表达水平显著低于 0 U/L 组,80U/L组显著低于 20U/L 组,差异均有统计学意义(P<0.01)。
  2.4 各处理组 MPA 和 CD11b的抑制率
  不同浓度药物与 PLT、Mo共孵育组 MPA 和 CD11b抑制率均显著高于其余两处理组,差异均有统计学意义(P<0.01),其余两组间抑制率差异无统计学意义(P>0.05);各处理组中,80U/L 组对MPA 和 CD11b的抑制率均显著高于 20U/L 组(P<0.01)。

  3 讨论

  MPA 中激活的血小板可使单核细胞信号转导通路活化、促使其分泌和表达多种活性因子、显著增强其趋化及黏附能力[5-6],从而导致内皮损伤并介导炎症细胞黏附[7]。因此,MPA 形成是 AS发生、发展早期的重要病理生理基础之一,而活化单核细胞与血管内皮细胞黏附后进入血管内皮细胞是 AS发生的关键[8]。因此,研究木瓜蛋白酶对 MPA 形成及其诱导的单核细胞活化的抑制作用,有助于阐明其在防治动脉粥样硬化性心脑血管疾病中的新机制。血小 板 活 化 表 达 的 P-选 择 素 (GMP-140,CD62P)是反映血小板活化的敏感标志物[9];活化血小板与单核细胞主要通过 P-选择素/P-选择素糖蛋白配 体-1(PS/PSGL-l)相互 作 用,促进单核细胞-血小板聚集体(MPA)形成,因此,P-选择素既是血小板活化的标志物,也是 MPA 形成的关键物质,血小板 P-选择素表达水平对 MPA 形成有决定性 作用[10]。活化 单 核细胞可 表 达 Mac-1受体(即 CD11b/CD18),因而 CD11b是单核细胞活化标志物[11]。本研究中,木瓜蛋白酶可导致血小板与单核细胞共同孵育后 MPA 形成、P-选择素和 CD11b表达明显降低,表明木瓜蛋白酶可抑制活化血小板表达 P-选择素,并对 MPA 形成具有抑制作用,从而导致单核细胞活化减少。因此,木瓜蛋白酶可抑制 MPA 形成,并能抑制 MPA 中单核细胞活化,从而可能对 MPA 参与动脉粥样硬化过程有抑制作用。进一步实验显示,木瓜蛋白酶与血小板孵育后 P-选择素表达显著降低,与我们早前的研究一致[3],同 时 MPA 形 成 和 CD11b 表 达 也 显 著 降低,二者变化趋势一致,这表明 P-选择素表达水平降低 是 MPA 形 成 减 少 的 根 本 原 因 之 一。因此,本结果也进一步印证和部分解释了前述的试验结果。本研究中,木瓜蛋白酶与单核细胞孵育后再加入活化血小板,MPA 形成和 CD11表达水平也显著降低;这进一步表明木瓜蛋白酶除可通过抑制血小板 P-选择素表达而抑制 MPA 形成,还可能通过对单核细胞的作用,抑制其与血小板P-选择素 或 者 其 他 途 径 的 结 合,从 而 协 同 抑 制MPA 形成。而我 们 进一步 发 现,木 瓜 蛋 白 酶 与血小板和 单 核 细 胞 共 孵 育 后 对 MPA 和 CD11b的抑制作用远高于其余两种处理方式,表明木瓜蛋白酶可通过抑制血小板活化以及抑制单核细胞的结合两条途径,从而使 MPA 形成减少及其诱导的单核细胞活化程度降低更加显著。因此,木瓜蛋白酶可能通过抑制血小板 P-选择素表达和单核细胞与血小板结合途径而对 MPA 形成及其诱导的单核细胞活化有抑制作用,这可能作为其应用于动脉粥样硬化及心脑血管疾病防治的新机制。但木瓜蛋白酶具体通过抑制何种信号转导机制从而抑制 MPA 形成和单核细胞活化需要做更深入的 研 究。 若 能 进 一 步 证 实 木 瓜 蛋 白 酶 对MPA 及其诱导的单核细胞活的抑制作用并阐明其机制,将有助于提升木瓜蛋白酶在动脉粥样硬化性心脑血管疾病的预防和治疗中应用价值。
 

参 考 文 献

[1] Saha P,Modarai B,Humphries J,et al.The mono-cyte/macrophage as a therapeutic target in athero-sclerosis[J].Pharmacology,2009,9(2):109-118.
[2] van Gils JM,Zwaginga JJ,Hordijk PL.Molecularand functional interactions among monocytes,plate-lets,and endothelial cells and their relevance forcardiovascular diseases[J].J Leuk Biol,2009,85(2):195-204.
[3] 费鲜明,周永列,祁金文,等.木瓜蛋白酶体外对血小板聚集的抑制作用[J].中国临床药理学与治疗学,2009,14(8):906-911
 

蒋 雷,费鲜明,苗成霖,袁武锋,邱莲女     浙江省人民医院检验医学中心


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