糖基转移酶GALNT2调控肺腺癌放射抵抗分析

肺癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率均居世界首位。流行病学监测结果发现肺癌 5 年生存率从 2011 年的 15.6%到 2019 年上升为 19.4%[39]。放射治疗是晚期肺癌患者最重要的治疗手段，放射抵抗是肺癌患者治疗失败的主要原因。目前研究表明，代谢、肿瘤微环境以及各种药物都在肿瘤放射抵抗中发挥一定的作用
一、引言

  肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，全球每年新发患者约 210 万，死亡例数约 180 万，发病率和死亡率均居各种恶性肿瘤的首位。在不同阶段和不同地区，肺癌 5 年生存率存在较大差异，大致在 4-17%之间变化[1]。目前，肺癌的主要治疗方式包括手术、放疗、化疗和免疫治疗。其中，晚期肺癌患者以放疗为主。然而，放疗失败的根本原因在于肿瘤细胞存在放射抵抗。由于放射抵抗，肺癌放疗后局部未控或复发率高达 60%-80%。因此，阐明肺癌放射抵抗的分子机制，是提高放疗疗效、改善患者预后的关键。

1.肺癌放射抵抗机制研究进展

  放疗用于治疗大约 50%的恶性肿瘤，术前可以进行放射治疗，以缩小肿瘤，或在术后杀死任何残留的癌细胞。放疗的目的是最大限度地损害癌细胞，同时最大限度地减少对健康细胞的损害。然而，放射抵抗仍然是临床上尚未攻克的障碍。肿瘤放射抵抗的产生是一个多模式、多因素共同调控的复杂过程，与肿瘤本身和周围微环境的一些生物改变有关。主要包括以下途径：改变的细胞周期、通过癌症干细胞再种群、缺氧、氧化应激的改变管理、逃避凋亡、改变 DNA 损伤反应和增强 DNA 修复、炎症、改变了线粒体功能和细胞能量学等[2]。肺癌放射敏感性的机制研究是目前关注的热点。越来越多的研究显示肺癌的放射抵抗受多种因子的调控。例如 miR-373[3]、miR-339-5p[4]、miR-21[5]等表达上调增强了肺癌细胞的放射抗性。miR-300[6]、miR-144-5p[7]、miR-99a[8]等表达下降则减弱肺癌细胞的放射抗性。BIBR1532，一种端粒酶抑制剂，可有效抑制端粒酶活性并增加射线诱导的端粒功能障碍，从而破坏染色体稳定性并阻断 DNA 损伤修复[9]。Ji[10]等发现 NAD+依赖性脱乙酰基酶 SirT1 通过 SirT1/NF-κB/Smac 途径调节肺癌细胞的凋亡和辐射敏感性。糖原合酶激酶 3β（GSK-3β）通过抑制自噬从而提高肺癌细胞的放射敏感性[11]。Sheng[12]等发现剪切因子 SRSF1 与外显子 PTPMT1剪接增强子结合以促进剪接，从而调控肺癌的放射抵抗。Ma[13]等证实β-Trcp 和RSK2 介导转录因子 FOXN2 降解，进一步促进了肺癌细胞的放射抵抗。Xiu[14]等发现 FOXM1 可通过诱导 KIF20A 表达来增强肺癌放射抗性。Xue[15]等发现长链非编码 RNA GAS5 通过抑制 miR-135b 在肺癌中的表达增加放射敏感性。Wang[16]等发现天然药物三阳血傣通过增加 iNOS/NO 的产生，导致肺癌细胞放射敏感性增加。然而，肺癌的放射抵抗机制复杂多样，目前尚未完全阐明，仍须寻找新的干预靶点和治疗策略。

2.糖基转移酶与肿瘤放射抵抗

糖基转移酶是存在于内质网和高尔基体中的一大类酶，参与多种生物活性物质如糖蛋白和糖脂中的糖链合成，从而实现糖基化修饰。糖基化是普遍存在的翻译后修饰，负责多种关键的生物学作用[17]。自然界超过 50%-70%的蛋白质是糖基化的[18]，糖基化修饰改变是肿瘤恶性转化的标志[19]。大量研究表明，糖基转移酶的表达改变在肿瘤放射抵抗中起关键作用。例如，Baro[20]等已经发现抑制寡糖转移酶是一种对恶性神经胶质瘤进行放射增敏的新方法。α1、6-岩藻糖基转移酶（FUT8）被证实是食管癌放射抵抗的驱动因素[21]。下调核心β1，3-半乳糖转移酶1（C1GALT1）的表达可增加食管癌细胞的放射敏感性[22]。Wu[23]等发现 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT-V）可调控鼻咽癌细胞的放射抵抗。Zhuo[24]等从体内外实验证明了 GnT-V 的下调增强了鼻咽癌细胞的放射敏感性。

二、材料与方法

1.实验材料

1.1 主要细胞系及来源

  肺腺癌细胞系 A549、H1299 细胞系购于 Procell 公司，肺腺癌放射抵抗细胞系A549R、H1299R 由本课题组构建和保存。1.2shRNA 和 siRNA 序列及来源本课题中所用的质粒和 siRNA 均由吉玛公司提供。

2.实验方法

2.1 生物信息学分析

（1）Oncmine 是一个癌症微阵列数据库和基于网络的数据挖掘平台，旨在通过全基因组表达分析和比较转录组来激发新的发现[38]。本实验中设置的数据提取条件为：①“Cancer Type: Lung Cancer” ；②“Gene: GALNT2” ；③“Data TypemRNA”；④“Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis”；⑤临界值设定条件(P-value<0.05，fold change>1.5，gene rank=top 10%)。

（2）GEPIA 数据库设置条件如下：①“Gene: GALNT2”；②“Datasets Selection:LUAD”；③ “Matched Normal data: Match TCGA normal data”；④临界值设定条件（｜Log2FC｜Cutoff：0.5，P value Cutoff：0.05）
（3）Kaplan-Meier Plotter 数据库设置条件如下：①“Cancer: Lung Cancer”；②“Gene: GALNT2” ；③ “Split patients by: median” ④“Survival: OS 或 PPS”

三、结果

1.GALNT2 在肺腺癌组织中高表达并与患者不良预后相关

1.1 基于 Oncomine 和 TCGA 数据库分析 GALNT2 在肺腺癌中的表达水平及预后在 Oncomine 数据库中，共收集了 326 项不同类型的研究结果，关于 GALNT2表达有统计学差异的研究结果有 34 项，其中 GALNT2 表达降低的研究有 5 项，表达增高的研究有 29 项(图 3.1A)。选取其中的 Okayama Lung 和 Stearman Lung 数据集分析发现：GALNT2 在肺腺癌组织中的表达明显高于肺组织（P<0.05，图 3.1B）。TCGA 数据库分析发现：与正常组织相比，GALNT2 在肺腺癌组织中的表达明显增高（P<0.05，图 3.1C）。Kaplan-Meier Plotter 生存分析显示，与 GALNT2 低表达的肺腺癌患者相比，GALNT2 高表达的肺腺癌患者的总生存期(OS)缩短（P<0.05，图 3.1D），这些结果表明，GALNT2 在肺腺癌组织中高表达并与肺腺癌患者的不良预后相关。

四、讨论

  肺癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率均居世界首位。流行病学监测结果发现肺癌 5 年生存率从 2011 年的 15.6%到 2019 年上升为 19.4%[39]。放射治疗是晚期肺癌患者最重要的治疗手段，放射抵抗是肺癌患者治疗失败的主要原因。目前研究表明，代谢、肿瘤微环境以及各种药物都在肿瘤放射抵抗中发挥一定的作用[40-43]。对肿瘤放射抵抗的研究已经进行了数十年，但尚未完全阐明肿瘤放射抵抗的成因。因此，对于肺腺癌细胞放射抵抗分子机制的进一步研究有助于临床治疗，对于判断预后、提高患者生存率具有重要意义。糖基化在各种生物学和医学领域的相关发现中发挥了重要作用，并为多种人类疾病的破译做出了贡献。聚糖参与癌症中发生的基本分子和细胞生物学过程，例如细胞信号传导和通讯、肿瘤细胞的解离和侵袭、细胞-基质相互作用、肿瘤血管生成、免疫调节和转移形成。糖基化的改变调节了癌症的发展和进程，成为重要的生物标志物[44, 45]。近年来，越来越多的研究发现糖基化在肿瘤放射抵抗中扮演着重要角色。比如，糖基转移酶 FUT8[21]、GnT-V[46]、C1GALT1[22]等已经被发现可以调控肿瘤的放射抵抗。本课题前期在肺腺癌细胞 A549 和 H1299 的基础上构建了放射抵抗的细胞模型 A549R、H1299R，通过质谱及数据库分析，发现 GALNT2是唯一在肺腺癌放射抵抗细胞 A549R 中呈高表达的糖基转移酶，并且通过 Westernblot 技术证实了 GALNT2 的表达上调。因此，可以得出结论，GALNT2 在肺腺癌放射抵抗细胞中表达特异性增加，并且 GALNT2 的表达与肺腺癌患者的不良预后密切相关

五、结论

（1）GALNT2 在肺腺癌组织中高表达，且与患者的不良预后密切相关。

（2）体内、外实验均证实 GALNT2 对肺腺癌放射抵抗具有调控作用。

（3）GALNT2 通过促进 IGF-1R O-糖基化从而介导肺腺癌放射抵抗。