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具有高载药量淫羊藿苷纳米粒的制备及其对LPS诱导H9c2细胞损伤的影响

时间:2021-11-24 10:16 | 栏目:药学实验性论文 | 浏览:

硕士论文网第2021-11-24期,本期硕士论文写作指导老师为大家分享一篇药学实验性论文文章《具有高载药量淫羊藿苷纳米粒的制备及其对LPS诱导H9c2细胞损伤的影响》,供大家在写论文时进行参考。
炎症反应是机体对于病理刺激的一种防御反应,常常会引发心血管疾病、脑部疾病、呼吸道疾病以及消化道疾病等多种疾病。由于大量促炎因子浸润在心脑血管组织中,引发一系列炎症反应,从而造成心脑血管器官功能减退,呈现病理性改变[43]。早期研究发现,经典促炎因子如 TNF-α 、IL-1β以及 IL-8 和 IL-6 等都可触发血管不可逆炎症
一、引言
  近年来,心血管疾病严重威胁着人类生命健康,死亡率位居首位,占全球所有死亡人数的 1/3。根据《中国心血管病报告 2020》最新数据显示,心血管疾病患病人数从 1990 年的 2.71 亿已增加到 5.23 亿。此外,心血管疾病死亡人数从 1990 年的1210 万增加至 1860 万(其中男性 960 万; 女性 890 万)[1]。并且中国居民的心血管疾病发病人群将由高龄人群向低龄低收入群体快速转移聚集的趋势,30-70 岁的人群中约有 610 万心血管疾病死亡[2]。由此可见,心血管疾病已经成为中国重要的公共卫生健康问题[3]。炎症是保护组织和器官免受许多病理性刺激的生理免疫反应[4],也是许多疾病发生发展的基础和主要过程,如糖尿病、心脏病、肿瘤、消化系统疾病、自身免疫性疾病以及阿尔茨海默病等疾病,其病理改变主要是导致细胞凋亡和坏死、器官特异性损伤、细胞刺激或癌症的发生[5, 6]。大量研究表明,炎症反应参与心室重塑的整个病理过程,是心脏损伤后心脏病理性重塑的主要因素[7, 8]。LPS(Lipopolysaccharides ,脂多糖)是革兰氏阴性菌细胞外壁的主要组成成分,由类脂 A、 核心多糖和侧链多糖三部分组成的糖脂类物质,其主要通过细胞膜表面的TLR4 受体 (Toll-like Receptor,Toll 样受体 4)促进各种炎症反应的发生[9]。已知这些心肌中促炎细胞因子包括 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-18,会导致心肌损伤和长期病理重塑[10]。当心肌出现梗死后,心肌细胞呈现出大片的凋亡和坏死,导致胶原基疤痕的形成。接着凋亡坏死细胞通过释放危险信号激活先天免疫途径,从而引起强烈的炎症反应[11]。与此同时,心肌受损释放出的损伤相关的分子模式(damageassociated molecular patterns,DAMPs)如 HMGB1 (high-mobility group box 1,高迁移率族蛋白 1)也可激活内皮细胞表达趋化因子受体的表达,遂而产生炎症因子并诱导心肌细胞坏死或凋亡。此外,HMGB1 可通过 CXCL12/ CXCR4 途径促进炎症细胞如巨噬细胞和中性粒细胞向受损心脏的聚积,进一步加剧了心脏负荷和损伤[12]。
所以阻断炎症反应的激活可以作为减轻心脏病理重塑的一种有效的策略。
淫羊藿苷分子结构示意图
二、材料与方法
1.材料
1.1 实验细胞
细胞株:H9c2 大鼠心肌细胞,购自中国科学院细胞库
1.2 主要试剂
主要试剂
2. 实验方法
2.1 mPEG-ICA(d) 纳米粒的制备与合成
(1)mPEG-COOH 的合成称
  取 5.00 g mPEG、0.40 g 丁二酸酐(SA)、0.50 g 4-二甲氨基吡啶 (摩尔比 1:1.5:1.5)于 250 mL 圆底烧瓶中,加入 50 mL 去水二氯甲烷,在 60℃冷凝回流搅拌器反应 2 h。将反应物置于旋转蒸发仪中 12 h(35℃下除去二氯甲烷),得到白色固体。常温常压下放置半天后加入 50 mL 双蒸水中溶解,于 2 KDa 透析袋中透析 48 h,期间不停换水,以去除溶解的 SA,随后过滤掉未被溶解的 SA。将滤液冷冻干燥得到羧基化的 mPEG(mPEG-COOH),称重。
(2) mPEG-ICA 聚合物的合成
  称取 0.37 g mPEG-COOH、0.024 g N-羟基琥珀酰亚胺、0.026 g 4-二甲氨基吡啶加入 250 mL 圆底烧瓶中,量取 10 mL 二甲亚砜(DMSO)加入其中,置于恒温加热磁力搅拌器充分搅拌 12 h,以达到活化羧基的目的。称取 100 mg 淫羊藿苷标准品于小试管中,加入 5 mLDMSO 充分溶解,将溶解混合物倒入圆底烧瓶中,室温下搅拌反应 48 h。用双蒸水透析,期间不停换水,直至无 DMSO 气味。将透析后所得物质在真空冷冻干燥机冷冻干燥 48 h,得到浅黄色产物即 mPEG-ICA 聚合物。
(3) mPEG-ICA(d) 纳米粒的合成
  称取 5 mg mPEG-ICA 聚合物于小试管中,加入 2 mL DMSO 溶解,然后在 37℃水浴锅中摇晃 5 min。再称取 5 mg ICA 溶于适量的 DMSO 中,放入小烧杯中,将烧杯置于恒温加热磁力搅拌器上,缓慢向小烧杯中加入已溶于 DMSO 的 mPEG-ICA聚合物,混合搅拌 2 min 后,加入 5 mL 蒸馏水,在室温下搅拌 15min 后停止搅拌。然后将反应物盛于 3.5 KDa 透析袋中,于双蒸水中透析 24 h,期间要不停换水,直至 DMSO 溶剂透析干净,过滤后得到 mPEG-ICA(d) 纳米粒。
三、结果
1. mPEG-ICA(d) 纳米粒的物理特征
1.1 红外吸收光谱
  红外吸收光谱是一种根据分子中的特征频率确定其主要官能团信息的分析方法,通过解析淫羊藿苷、mPEG-COOH、mPEG-ICA 纳米粒的红外光谱差异,可判断淫羊藿苷是否结合在 mPEG 纳米载体上。如图 1 所示,从淫羊藿苷的红外谱图上可以看到淫羊藿苷主要共有特征峰为:3440 cm-1,2960 cm-1,2840 cm-1,1650cm-1,1600 cm-1,1350 cm-1,1260 cm-1,1180 cm-1,等,其中 3440 cm-1 为淫羊藿苷中酚羟基的伸缩振动峰,由于分子中酚羟基较多,发生缔合现象,从而出现一个强而宽的吸收峰,1650 cm-1是淫羊藿苷分子中 C=C 伸缩振动峰,1600 cm-1是 C=O伸缩振动峰,由于 C=C 与 C=O 的共轭效应形成强峰,1260 cm-1 是 C-O 的伸缩振动峰。由 mPEG-COOH 红外图谱可以看到明显的亚甲基峰,以及在 1720 cm-1处是羧基(-COOH)的单体伸缩振动峰,1620 cm-1 是 mPEG-COOH 分子中 C=O 伸缩振动峰,而在它旁边的 1740 cm-1 的峰则是的酯键(-C=O-)的伸缩振动吸收峰,
表现的较为明显,说明聚乙二醇单甲醚羧基化成功。从 mPEG-ICA 聚合物红外图谱可以看出,1740 cm-1 处与 1700 cm-1 处淫羊藿苷图谱相比多两个酯键(-C=O-)的伸缩振动吸收峰,并且与 mPEG-COOH 红外图谱相比 1650 cm-1 存在 C=C 伸缩振动峰,由此可以推断 mPEG 纳米载体上中含有淫羊藿苷,mPEG-ICA 纳米粒制备成功。
mPEG-ICA(A),ICA(B)和 mPEG-COOH(C)红外光谱图
1.2 核磁共振氢谱
  核磁共振氢谱是利用核磁共振仪记录下原子在共振下的有关信号绘制的图谱,是一种可被用来确定分子的结构的分析方法。通过解析淫羊藿苷、mPEG-COOH、mPEG-ICA 纳米粒的氢峰差异,可判断淫羊藿苷是否结合在 mPEG纳米载体上。如图 2 所示,从 mPEG-ICA 氢谱可以看到在 7.5 ppm 附近出现苯环氢峰,3.5 ppm 峰面积非常大,判断为聚合物 mPEG 中-CH2-O-氢峰,0-2 ppm 附近为 ICA 上羟基氢信号,1.7 ppm 为 ICA 中双键氢峰,可以看到 mPEG-COOH 和 ICA的特征峰相应在 mPEG-ICA 中出现由此可以证明 mPEG-COOH 与 ICA 合成成功mPEG-COOH 和 mPEG-ICA 核磁共振氢谱图
 
四、讨论
  炎症反应是机体对于病理刺激的一种防御反应,常常会引发心血管疾病、脑部疾病、呼吸道疾病以及消化道疾病等多种疾病。由于大量促炎因子浸润在心脑血管组织中,引发一系列炎症反应,从而造成心脑血管器官功能减退,呈现病理性改变[43]。早期研究发现,经典促炎因子如 TNF-α 、IL-1β以及 IL-8 和 IL-6 等都可触发血管不可逆炎症[44]。LPS 是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分,是由脂质和多糖构成的糖脂质化合物。并且 LPS 可诱导心肌炎症的发生,与心血管疾病高度相关。研究发现淫羊藿苷具有多种药理活性,对于 LPS 诱导引起的心血管炎症有良好的治疗效果;但由于其肝脏首过效应明显、水溶性差,导致其生物利用率低,临床应用受限。研究表明,将 ICA 与纳米药物载体相结合可以改善药物的传递特性[45-47]。所以,我们以 ICA 为出发点,研究了 mPEG-ICA(d) 纳米粒对LPS 诱导的 H9c2 心肌细胞的影响。我们通过化学连接方法将 mPEG 和淫羊藿苷组装成高分子纳米粒,合成 mPEG-ICA 聚合物,再通过物理包埋方法进而合成mPEG-ICA(d) 纳米粒。用以上方法制备出来的 mPEG-ICA(d) 纳米粒改善了 ICA的药物传递特性和其药物载量,同时增加了 ICA 的水溶性以及药物释放量,提升了 ICA 的药物缓释作用时间
五、结论
1. 成功制备了新型 mPEG-ICA(d) 纳米粒,将疏水性药物 ICA 转化为水溶性纳米药物,相比于 mPEG-ICA 聚合物,成功提高了药物 ICA 的负载量,延长了 ICA的缓释时间;
2. mPEG-ICA(d) 纳米粒在弱酸性溶液的释放特性可能有利于心肌炎症性损伤的治疗;
3. mPEG-ICA(d) 纳米粒能有效减轻 LPS 诱导的细胞损伤,提示 mPEG-ICA(d) 纳米粒可能对 LPS 诱导的心肌炎症有一定的保护作用

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